莱姆病螺旋体PCR-DHPLC图谱的建立及伯氏疏螺旋体OspA的表达纯化

【摘要】目的：为了应用PCR-DHPLC技术对莱姆病螺旋体进行准确、快速、高通量的分型检测；为了后续制备胶体金试纸，进行现场快速诊断，对致病性伯氏疏螺旋体外膜蛋白A(Outersurfaceprotein,OspA)进行原核表达，为莱姆病螺旋体的快速检测做准备工作。方法：以世界范围内常见的3种莱姆病螺旋体致病菌株（阿氏疏螺旋体、伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体）为研究对象。应用Genbank设计种属特异型基因序列OspC通用引物，应用PCR方法扩增3种致病菌的特异序列，联用DHPLC对扩增片段进行分型检测。此过程中进行PCR-DHPLC参数的优化，应用48株非螺旋体致病性菌株验证PCR-DHPLC的灵敏度、特异性，并将此方法应用到实际样品检测中；为了应用间接酶联免疫法检测抗体，本研究表达OspA蛋白，为后续制备胶体金试纸做准备。首先通过查找相关文献，选取在伯氏疏螺旋体感染中大量表达的OspA，针对其序列设计引物,在两端加入酶切位点NdeI/XhoI，获取带有酶切位点的目的基因序列。双酶切后联入带有His标签pET-28b载体，将构建成功的重组表达载体转入BL21(DE3)表达菌株。通过改变诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度，确定重组融合蛋白的最佳表达条件，分别选取诱导剂IPTG的浓度0.3mM、0.5mM、0.7mM，诱导时间0h、1h、2h、3h、4h、5h，诱导温度25℃、30℃、37℃，应用超声破碎、6M盐酸胍溶解、SDS-PAGE鉴定pET-28b-rOspA蛋白表达形式，应用WesternBlotting鉴定pET-28b-rOspA融合蛋白的正确性和特异性。通过镍柱纯化所获得融合蛋白，改变洗脱液的浓度以达到最优的洗脱目的。结果：应用特异性通用引物扩增OspC产物片段，长度分别为633bp、630bp、630bp。测序后，通过比对，扩增序列完全正确；将扩增好的片段无需其他处理可直接上样于DHPLC中，结果表明，在部分变性条件下55.8℃时，能通过DHPLC将3种螺旋体致病菌进行区分。从而各自出现了特异性的分离图谱，可以很明显地从检测图谱上区分3种莱姆病螺旋体致病菌种；通过PCR-DHPLC分型检测方法，建立莱姆病致病菌株标准图谱，PCR-DHPLC方法灵敏度在核酸水平上达0.01pg/μL，具有良好特异性。成功构建重组伯氏疏螺旋体pET-28b-rOspA表达载体，经测序验证，转入BL21(DE3)，经过IPTG诱导，确定最佳表达条件，即IPTG诱导浓度为0.5mM、温度为37℃、诱导时间为4h。通过SDS-PAGE确定其为包涵体表达，经Westernblotting验证，经镍柱纯化，获得纯度较好OspA蛋白。结论：本研究成功建立3种莱姆病螺旋体致病菌PCR-DHPLC标准图谱；通过构建重组pET-28b-rOspA质粒，表达纯化后，获得纯度较好OspA蛋白，为后续制备莱姆病螺旋体检测试纸奠定了基础。
【作者】郑旭；
【导师】乔萍；
【作者基本信息】吉林大学，药理学，2014，硕士
【关键词】莱姆病；伯氏疏螺旋体；PCR-DHPLC；分型鉴定；原核表达；

【参考文献】
[1]常海峰.我国社会保障制度的发展与改革探析[D].吉林大学,国民经济学,2004,硕士.
[2]时小波.复杂运营条件下桥上有砟轨道无缝线路力学行为研究[D].北京交通大学,2014.
[3]陈倩.基于Realms的时空分析数据库系统STADBSⅡ的设计与实现[D].南京航空航天大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[4]唐晶晶.民族院校“大学语文”教材比较研究[D].西藏大学,教育,2013,硕士.
[5]李华亮.班公湖—怒江缝合带西段洋陆转换的标志及时间[D].中国地质大学,构造地质学,2014,博士.
[6]秦凯.优化纳税服务研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[7]王蕾.《艺概·书概》中的书学思想探析[D].内蒙古师范大学,文艺学,2012,硕士.
[8]凌云.模型初至地表一致性静校正[J].石油地球物理勘探,1992,03:351-360+430.
[9]庾志成.移动增值业务发展趋势探讨[J].现代电信科技.2005(05)
[10]刘胜利.基于SVM的网络入侵检测研究[D].大连海事大学,交通信息工程及控制,2004,硕士.
[11]吕敏健,阮健,左强,时梦,励伟.正开口2D数字伺服阀动态特性实验研究[J].机床与液压,2013,11:1-4.
[12]田润泽.法律经济学视角下的我国缺陷产品召回制度[D].四川省社会科学院,法律（专业学位）,2014,硕士.
[13]林刚.基于Fedora的泸医数字资源管理系统的研究与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[14]曹祖凤.多租户SaaS应用优化部署算法的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[15]王文斌.瑞和装饰IPO股份支付会计应用的影响案例分析[D].兰州大学,会计,2014,硕士.
[16]何桦,卫志农,顾全,孙国强.EMS中基于量测置换的对地电容参数估计方法[J].电力系统自动化,2007,13:63-66.
[17]鞠思敏.血清分泌型卷曲相关蛋白5与2型糖尿病及肥胖的相关性研究[D].苏州大学,临床医学（专业学位）,2014,硕士.
[18]孔祥华.石墨烯生长所需的自清洁基底-氧化铜[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第30分会：低维碳材料[C].中国化学会:,2014:1.
[19]陈翀,谭克虎.法国铁路转换经营机制及多元化经营问题研究[J].经济问题探索,2014,02:131-136.
[20]张南.运脾固肠汤治疗小儿脾虚泻的临床疗效观察[D].湖南中医药大学,中医儿科学（专业学位）,2013,硕士.
[21]李超群.历史哲学指导下的马克思主义法律思想[D].西南政法大学,法学理论,2012,硕士.
[22]苏守宝,郁书好.一种基于密度的增量式网格聚类算法[J].皖西学院学报,2004,05:91-94.
[23]迟国泰,王际科.大连理工大学应用数学系,杜娟.基于灰色系统理论的商业银行竞争力评价模型[J].控制与决策,2006,03:347-351.
[24]徐方毅.TRIP800钢和热成形钢的Q&P工艺研究[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[25]陈婧.脑心通胶囊对脑梗死恢复期和后遗症期气虚血瘀证患者肱动脉内皮功能的影响[D].北京中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[26]冯歆宇.博物馆特展研究[D].浙江大学,考古学及博物馆学,2012,硕士.
[27]李方方.S~(n+p)中M(o|¨)bius第二基本形式平行的子流形[D].郑州大学,基础数学,2013,硕士.
[28]阎凤翔.太原东山黄土静力与动力性质研究[D].太原理工大学,岩土工程,2004,硕士.
[29]常征.我国房地产开发的建筑策划程序研究[D].清华大学,2004.
[30]王腾.中国海洋经济发展效率及其可持续性研究[D].华中师范大学,区域经济学,2013,硕士.
[31]杨分成.论我国商标抢注的法律规制[D].宁波大学,法律,2014,硕士.
[32]李斌.马王堆汉墓刺绣纹样在室内装饰中的应用研究[D].中南林业科技大学,林业工程,2014,硕士.
[33]马玲,张婷,冯素玲.石墨烯修饰电极对维生素B_(12)的电化学响应及其分析应用[J].分析试验室,2014,05:614-617.
[34]杨凯,胡立磊,程亮,史晓泽,刘庄.基于功能化石墨烯-磁性纳米颗粒复合物的多模式成像指导下的光热治疗[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[35]孙华,杜友福,李克清.数据库中一种挖掘数值属性关联规则的方法[J].江汉石油学院学报,2003,S1:160-161+11.
[36]夏小红.湘西苗画的艺术特色及保护意义研究[D].武汉纺织大学,设计艺术学,2013,硕士.
[37]吴秀明,章涛.当代文学史料研究的历史源流与现实发展[J].天津社会科学,2014,04:96-106.
[38]程牛.高层框—剪结构考虑高振型的能力谱法研究[D].安徽建筑工业学院,结构工程,2012,硕士.
[39]梁奎端.程控交换机房选址时对电磁环境的考虑[J].现代电信科技.1997(04)
[40]符力耘,程胜,段玉.地震波阻抗反演的ANNLOG技术及其应用效果[J].石油地球物理勘探,1997,01:34-44+154.
[41]杨秋香.当归多糖对2型糖尿病预防及治疗作用的初步研究[D].华中科技大学,中药学,2013,硕士.
[42]曾志成.两种不同桩锚支护体系受力机理的数值研究[D].长安大学,岩土工程,2014,硕士.
[43]祁荣宾,罗秋滨,冯汝鹏.基于扩张状态观测器的混沌系统同步[J].控制与决策,2005,01:106-108+116.
[44]张益民.煤质分析仪的机械传动及其控制系统的设计与实现[D].郑州大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[45]张运诗.分布式预测函数控制及其应用研究[D].苏州大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[46]杜金莲,郭文君,迟忠先.用神经网络选择多维数据挖掘空间的研究[J].小型微型计算机系统,2002,09:1100-1103.
[47]李瑞雪.碳氮比对厌氧发酵生物制氢影响规律的研究[D].西北大学,无机化学,2014,硕士.
[48]麦华明.BMP-2、bFGF在牵张成骨中的表达及作用[D].广西医科大学,口腔临床医学,2004,硕士.
[49]黄志中.唐都医院门诊排队系统的优化研究[D].西北大学,高级工商管理（EMBA）（专业学位）,2014,硕士.
[50]李晓霞.一种用于片上网络交换结构的动态优先级算法[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.